专利名称 ---【 用免疫捕获双重RT-PCR同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法 】

基本信息
申请号
CN201610210126.0
申请日
2016.04.07
公开(公告)号
CN105713994A
公开(公告)日
2016.06.29
申请(专利权)人
中国科学院寒区旱区环境与工程研究所
申请人地址
730000 甘肃省兰州市城关区东岗西路320号
发明人
张玉宝;王亚军;谢忠奎;王若愚;杨果;郭志鸿;王乐; 专利类型 发明专利
摘要
本发明提供了一种免疫捕获双重RT?PCR同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒的方法,其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV和LMoV的多克隆抗体特异性捕获LSV和LMoV粒子、利用LSV和LMoV的特异性引物进行双重反转录聚合酶链式反应RT?PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段;该方法将ELISA和RT?PCR结合,对现有的免疫捕获RT?PCR进行了改进,实现了用免疫捕获RT?PCR同步检测两种百合病毒LSV和LMoV,从而完善了免疫捕获RT?PCR技术。
主权项
一种用免疫捕获双重RT?PCR同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:①引物设计根据LSV和LMoV的CP基因序列,?设计LSV和LMoV的特异性正向和反向引物;②免疫捕获1)取100mg复合感染LSV+LMoV的组织,加1mL?PBST研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中,4000rpm离心2min,上清液即感病组织粗提液;2)用pH9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV和LSV多克隆抗体稀释后混合,使LMoV和LSV两种抗体的终浓度分别为1μg/mL和10μg/mL;取200μL上述稀释的混合抗体加入PCR管,37℃孵育2h;3)弃去包被液,用PBST洗3次,每次3min;?加入200μL感病组织粗提液,37℃孵育3h;4)弃去抗原液,用?PBST洗3次,ddH2O洗1次,短暂离心,吸去残液;③双重RT?PCR1)?在包被过的PCR管中分别加入10?μmol/L的LSV特异性反向引物LSV?R?2μL、10?μmol/L的LMoV特异性反向引物LMoV?R?2μL以及ddH2O?8μL,混合后于70℃保温10min,之后迅速冰浴2?min;2)双重RT:向上述PCR管中分别加入5×M?MLV?buffer?4μL、10mmol/L?的dNTP混合物2μL、30U/μL的RNase抑制剂0.68μL、200U?/μL?的M?MLV反转录酶0.70μL以及DEPC?H2O?0.62μL,混合均匀后,42℃水浴1h,70℃保温15?min,得到cDNAs混合物;3)双重PCR:取一新的PCR管,分别加入上述cDNAs混合物2.0μL、10×PCR?buffer?2.5μL、25?mmol/L?的MgCl2?2.5μL、2.5mmol/L?的dNTP混合物2.5μL、10μmol/L?的LSV特异性正向和反向引物LSV?F?和LSV?R?各0.5μL、10μmol/L?的LMoV特异性正向和反向引物LMoV?F?和LMoV?R?各0.5μL、5U/μL的Taq?DNA聚合酶?0.3μL以及ddH2O?13.2μL,混合均匀后进行双重PCR;上述双重PCR的反应条件为:?94℃预变性4min,94℃变性30s,50℃~58℃退火45s,72℃延伸1min,扩增30~35个循环,72℃延伸7min,降至常温;④双重PCR反应结束后取10μL反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳,在1×TBE缓冲液环境中,100V稳压电泳40min,然后用凝胶成像系统并观察并记录结果;⑤根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV或LMoV,若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV;若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV;若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段,则说明样品中同时含有LSV和LMoV。

 

IPC信息
IPC主分类号
C12Q1/70(2006.01)I
IPC分类号
C12Q1/70(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12R1/94(2006.01)N

 

法律状态信息
法律状态公告日
2020.02.18
法律状态
授权 法律状态信息
授权
法律状态公告日
2016.07.27
法律状态
实质审查的生效 法律状态信息
实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/70
法律状态公告日
2016.06.29
法律状态
公开 法律状态信息
公开

 

代理信息
代理机构名称
代理人姓名

 

被引专利信息
引用阶段 被引时间 专利号 申请人 公开时间
SEA null CN1793858A YUNNAN UNIV OF AGRICULTURE [CN] 20060628
SEA null CN1873019A YUNNAN PROVINCIAL A A S [CN] 20061206
SEA null KR20150145771A REPUBLIC KOREA MAN RURAL DEV [KR] 20151231

 

被引非专利信息
引用阶段 被引时间 被引文档类型 被引文档信息
SEA null s YUN ZHENG等:Specific and Rapid Detection of Lily symptomless virus and Arabis mosaic virus in Lily by Dual IC-RT-PCR,《J PHYTOPATHOL》
SEA null s KIM ET AL.:Development of an Indirect ELISA and Immunocapture RT-PCR for Lily Virus Detection,《J. MICROBIOL. BIOTECHNOL.》
     分享到:0


| 联系我们 | 网站地图 | 版权声明 |

版权:中国科学院 主办:中国科学院科技促进发展局 承办:中国科学院成都文献情报中心 蜀ICP备05003827号-12

建议使用1024×768 分辨率 IE6.0以上版本浏览器