专利名称 ---【 一种分离猪肝干细胞的方法 】

基本信息
申请号
CN03156803.3
申请日
20030908
公开(公告)号
CN1233821C
公开(公告)日
20050316
申请(专利权)人
中国科学院动物研究所
申请人地址
100080北京市海淀区中关村北四环西路25号
发明人
丰美福;何祖平; 专利类型 发明专利
摘要
本发明涉及一种分离猪肝干细胞的方法,该方法结合了大部分肝切除、酶消化与密度梯度离心法,分离出猪肝干细胞,其步骤包括:大部分肝切除促进肝再生、胶原酶将肝组织消化为单个细胞、离心去除肝内的成纤维细胞、蛋白酶E特异性消化肝实质细胞,而保留肝非实质细胞、Percoll密度梯度离心进一步纯化。本发明提供的方法能获得纯度高、数量多且活性好的猪肝干细胞,为猪肝干细胞的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源。
主权项
1、一种分离猪肝干细胞的方法,其包括如下步骤: 1)按常规方法进行猪肝大部分切除术; 2)术后饲养5~10天,每天向步骤1)处理的试验猪的腹腔注射30~80ml含100IU 抗生素的10wt%葡萄糖溶液; 3)取出试验猪的肝组织,置于冰浴的平皿内,剪除被膜血管,使用冷Hank’s平衡盐 溶液洗涤,剪碎肝组织块; 4)加入50ml含0.02~0.03wt%EDTA的0.020~0.040wt%胶原酶,在37℃下于恒温振 荡器上消化15~20分钟,加等体积Hank’s平衡盐溶液终止消化; 5)过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块,以500~1000rpm转速离心 3~5min,分出的上清液再以1500rpm转速再离心5~10min; 6)向步骤5)得到的沉淀物加入50ml的DMEM培养基,在37℃于恒温振动器上消 化15~20分钟,消化1~3次,然后以1500rpm转速离心8~12min;所述的DMEM 培养基包括0.008~0.012%wt/v蛋白酶E、0.010~0.012%wt/v胶原酶和 0.0035~0.0045%wt/v脱氧核糖酶I; 7)向步骤6)得到的沉淀物,按3ml/108细胞的量加入含NH4Cl的Tris缓冲溶液, 处理1~5min,再加入50ml冷Hank’s溶液洗涤后,以1500rpm转速离心5~10min; 8)倾出上层清液,沉淀物加入10ml?Gey’s平衡盐溶液,制成细胞悬液; 9)向离心管中依次加入10ml的28.7%wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮,10ml?17.2%wt/v聚 乙酰胺吡咯烷酮,10ml?Gey’s平衡盐溶液和10ml步骤8)制得的细胞悬液,室温 下以1500rpm转速离心15~20min,收集17.2%wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮和 28.7%wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮交界面的细胞,得到猪的肝干细胞。

 

IPC信息
IPC主分类号
C12N5/06

 

法律状态信息
法律状态公告日
20111123
法律状态
授权 法律状态信息
CN03156803 20051228 授权 授权
法律状态公告日
20050518
法律状态
专利权的终止 法律状态信息
CN03156803 20050316 公开 公开
法律状态公告日
20050316
法律状态
公开 法律状态信息
CN03156803 20050518 实质审查的生效
法律状态公告日
20051228
法律状态
实质审查的生效 法律状态信息
CN03156803 20111123 专利权的终止 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 5/06申请日:20030908授权公告日:20051228终止日期:20100908

 

代理信息
代理机构名称
北京泛华伟业知识产权代理有限公司 11280
代理人姓名
王凤华

 

被引专利信息
引用阶段 被引时间 专利号 申请人 公开时间

 

被引非专利信息
引用阶段 被引时间 被引文档类型 被引文档信息


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