专利名称 ---【 基于磁珠和纳米金探针的基因或基因突变的测定方法 】

基本信息
申请号
CN200710170619.7
申请日
20071119
公开(公告)号
CN101182580B
公开(公告)日
20080521
申请(专利权)人
中国科学院上海微系统与信息技术研究所
申请人地址
200050 上海市长宁区长宁路865号
发明人
贾春平;赵建龙;毛红菊;金庆辉; 专利类型 发明专利
摘要
本发明是一种基于磁珠及纳米金的、不依赖于聚合酶链反应的高灵敏度的基因或基因突变的测定方法。首先用生物素标记的与待测DNA互补的DNA探针(捕捉探针1)通过生物素-链亲和素反应标记到磁珠上,在胶体金上也标记与待测DNA互补的另一种DNA探针(捕捉探针2),在胶体金上同时还标记一种与待测DNA无同源序列的DNA探针,称为信号探针,将标记好探针的磁珠及纳米金探针与待测DNA混合在一定温度下杂交,然后再洗去没有反应的纳米金探针,再用巯基乙醇将纳米金探针上的信号探针DNA通过巯基还原洗脱下来,对该DNA进行定量检测,从而达到检测待测DNA的目的。
主权项
基于磁珠和纳米金探针的基因或基因突变的测定方法,包括首先用生物素标记的与待测DNA互补的DNA探针——捕捉探针1,通过生物素‑链亲和素反应标记到磁珠上,在胶体金上也标记与待测DNA互补的另一种DNA探针——捕捉探针2,在胶体金上同时还标记一种与待测DNA无同源序列的DNA探针——信号探针,其次将标记好探针的磁珠及纳米金探针与待测DNA混合杂交,然后再洗去没有反应的纳米金探针,再用巯基乙醇将纳米金探针上的信号探针DNA通过巯基还原洗脱下来,对该DNA进行定量检测;其特征在于所述的测定方法检测流程是:a)目的基因组DNA的提取采用酚/氯仿法抽提目的基因组DNA,且将基因组DNA处理成300‑500bp的片段;b)DNA探针标记磁珠取链亲和素包被的磁珠100‑300μl,先用100‑300μl0.1M的磷酸缓冲液PBS洗2‑3次,加入生物素标记的DNA捕捉探针1,使其终浓度1‑3nM,杂交反应液为PBS,室温缓慢摇动,反应30分钟‑1小时,引入磁场,磁铁上放置4min,弃上清,并洗涤3‑4次,以洗去未标记上的DNA探针,再用PBS重悬,4℃保存;c)DNA探针标记纳米金取浓度为8‑10nM的10‑30nm的纳米金1ml,14,000rpm离心45分钟‑1小时,去上清,用200μl无菌去离子水或PH为7.4的TE重悬,再加入1∶60‑1∶100混合的捕捉探针2和信号探针DNA的混合物6‑10μl,使DNA探针的终浓度为3‑5μM,室温放置16小时以上;再分3次逐渐加入1M NaCl、0.1M PH为7.2PB至终浓度分别为0.1M、10mM,充分混匀,室温放置48小时以上;14,000rpm离心45分钟‑1小时,去上清,用0.1MPBS洗液洗两次,再加适当量含50%的无菌甘油的0.1M PBS,4℃储存备用,用紫外分光光度计测其OD值,换算成浓度;d)杂交反应将标记有捕捉探针1的磁珠0.5‑1μl,与经超声及高温变性处理的待测靶标序列,在35‑45℃温度下杂交30‑45分钟,杂交液为:含有0.025%Tween‑20的PBS,再加入标记有捕捉探针2及信号探针的纳米金探针,继续杂交45分钟‑1小时,形成磁珠‑待测DNA‑纳米金探针复合体;引入磁场,富集磁珠,去上清,洗涤磁珠3‑4次,洗去未反应的纳米金探针;e)信号探针的洗脱向形成的磁珠‑待测DNA‑纳米金探针复合体中加入20‑40μl的8‑10mM巯基乙醇缓冲液,37℃孵育1‑3小时,将信号探针从纳米金上还原下来,加磁场,收集上清;f)信号探针的检测将收集到的上清,再添加杂交缓冲液,置于可检测信号探针的芯片上杂交,杂交40分钟‑1小时后清洗,再与可检测信号探针的纳米金探针杂交、清洗、晾干,银染,观察、扫描;所述的磷酸缓冲液PBS组成为:137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,4.3mmol/L Na2HPO4.7H2O,1.4mmol/L KH2PO4,PH为7.2;所述的PB组成为:0.2M Na2HPO4,0.2M NaH2PO4;所述的PH为7.4的TE缓冲液组成为:10mmol/L Tris‑HCl,1mmol/L乙二胺四乙酸钠;所述的杂交缓冲液为0.1MPBS、质量百分数为0.1%BSA、体积百分数为0.05%Tween20;所述的洗液为0.1MPBS和体积百分数为0.05%Tween20。

 

IPC信息
IPC主分类号
C12Q1/68

 

法律状态信息
法律状态公告日
20080521
法律状态
公开 法律状态信息
CN200710170619 20080521 公开 公开
法律状态公告日
20080716
法律状态
实质审查的生效 法律状态信息
CN200710170619 20080716 实质审查的生效 实质审查的生效
法律状态公告日
20120829
法律状态
授权 法律状态信息
CN200710170619 20120829 授权 授权
法律状态公告日
20181106
法律状态
专利权的终止 法律状态信息
CN200710170619 20181106 专利权的终止 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12Q 1/68授权公告日:20120829终止日期:20171119

 

代理信息
代理机构名称
上海智信专利代理有限公司 31002
代理人姓名
潘振甦


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