专利名称 ---【 一种杀虫增效蛋白的制备方法及用途 】

基本信息
申请号
CN201010268069.4
申请日
20100831
公开(公告)号
CN101942462B
公开(公告)日
20110112
申请(专利权)人
中国科学院武汉病毒研究所
申请人地址
430071 湖北省武汉市武昌小洪山
发明人
孙修炼;刘向阳; 专利类型 发明专利
摘要
本发明公开了一种杀虫增效蛋白的制备方法及用途,其步骤:A) 根据CpGV orf13的序列,设计引物,以CpGV基因组DNA为模板进行PCR扩增截短片段;B) PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,用PCR回收纯化试剂盒回收PCR产物,与pMD18-T载体连接;C) 提取质粒酶切鉴定阳性克隆子并测序,回收目的片断,亚克隆至表达载体pET-28a,为pET-28a-Cp13;D) 将pET-28a-Cp13转化大肠杆菌DH5α,提取质粒鉴定,用质粒转化大肠杆菌BL21,加IPTG诱导表达;E) SDS-PAGE分析检测表达产物,得到Cp13蛋白。表达的Cp13蛋白可采用His纯化树脂Ni-NTA进行纯化。原核表达的Cp13能显著提高多种昆虫病毒和Bt药物的杀虫活性,破坏昆虫中肠围食膜的完整性。该增效蛋白使用方便,安全环保,无毒性无副作用。
主权项
一种杀虫增效蛋白的制备方法,其步骤是:A)根据CpGV orf13的序列,从第94个核苷酸处始,设计一对引物,上游引物P1‑1:5’‑cgc ggatcc atgccgttggcgagacagcg‑3’;下游引物P2‑1:5’‑ccc aagctt ctacaaatcacttttcgtttgctt‑3’;B)以CpGV基因组DNA为模板进行PCR扩增截短片段663bp,PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃ 45s,55℃ 45s,72℃ 1min为一个循环,进行30个循环;最后72℃延伸10min;C)反应产物用0.8%质量/体积琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,用PCR回收纯化试剂盒纯化和回收PCR产物,与pMD18‑T载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,挑取白斑接入5ml LB培养基中振荡培养过夜;D)提取pT‑Cp13质粒酶切鉴定阳性克隆子并测序,从鉴定正确的阳性克隆子酶切回收目的片断,亚克隆至表达载体pET‑28a,命名为pET‑28a‑Cp13;E)将pET‑28a‑Cp13转化大肠杆菌DH5α,取转化菌均匀涂在选择性LA平板上,37℃倒置培养14h,挑取克隆子接入5ml含有相应抗生素的LA培养基中振荡培养过夜,提取质粒进行酶切鉴定;F)用鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21,将转化菌均匀涂在选择性LA平板上,37℃倒置培养14h,从中挑取单菌落接种于5ml液体LB培养基,37℃振荡培养过夜,取过夜培养物按照1%体积的比例转接于5ml新鲜的液体LB培养基,37℃振荡培养至OD600为0.6,加IPTG至终浓度为1mM,诱导表达0、1、3、6h后取样,以没有连接目的片断的空载体pET‑28a诱导6h为阴性对照;G)所取的样离心收集菌体,重悬于PBS缓冲液中,进行SDS‑PAGE分析检测,得到Cp13蛋白。

 

IPC信息
IPC主分类号
C12N15/34

 

法律状态信息
法律状态公告日
20120523
法律状态
授权 法律状态信息
CN201010268069 20120523 授权 授权
法律状态公告日
20170524
法律状态
专利申请权、专利权的转移 法律状态信息
CN201010268069 20170524 专利申请权、专利权的转移 专利权的转移IPC(主分类):C12N 15/34登记生效日:20170505变更事项:专利权人变更前权利人:武汉中科瑞昊科技发展有限公司变更后权利人:孙修炼变更事项:地址变更前权利人:430000 湖北省武汉市东湖高新技术开发区高新大道666号(武汉生物技术研究院B7栋2楼B102)变更后权利人:430000 湖北省武汉市武昌区八一路87号1栋14楼5号

 

代理信息
代理机构名称
武汉宇晨专利事务所 42001
代理人姓名
王敏锋


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